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    本生解析:操作細胞系步驟以及小技巧
    發布時間:2023-04-25瀏覽:95次

      本生解析:操作細胞系步驟以及小技巧


      脂質體作為體內和體外輸送載體的工具,已經研究的十分廣泛,中性脂質體是利用脂質膜包裹DNA,借助脂質膜將DNA導入細胞膜內。帶正電的陽離子脂質體,DNA并沒有預先包埋在脂質體中,而是帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質體上,形成DNA-陽離子脂質體復合物,從而吸附到帶負電的細胞膜表面,經過內吞被導入細胞。

      一、細胞系方法原理

      細胞系方法主要包括:電穿孔法、磷酸鈣沉淀法、脂質體轉染法、病毒介導的轉染等,理想的細胞轉染方法是具有高轉染效率、對細胞的毒性作用小等,本文主要介紹細胞轉染常用的方法-脂質體轉染的原理和操作步驟等。

      優點: 與其它方法相比,有較高的效率和較好的重復性,它適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中,是目前條件下蕞方便的轉染方法之一。

      二、細胞系操作步驟

      (1) 細胞系培養:取6cm細胞皿,向每孔中加入2mL含1~2×105個細胞培養液,37℃ CO2培養密度至40%~60%,密度過大,轉染后不利篩選細胞。

      (2) 轉染液制備:在EP管中制備以下兩液(為轉染每一個孔細胞所用的量)

      A液:用不含血清培養基稀釋1ug 質粒DNA。

      B液:用不含血清培養基稀釋2ul脂質體。

      分別將A液與B液輕彈混勻,靜置5分鐘。

      (3) 吸取B液加入至A液中,輕彈混勻。室溫中置10-15分鐘。

      (4) 轉染準備:用1mL不含血清培養液漂洗兩次,再加入4mL不含血清培養液。

      (5) 轉染:把A/B復合物緩緩加入培養液中,搖勻,37℃溫箱置6~24小時,吸除無血清轉染液,換入正常培養液繼續培養。

      (6) 瞬時轉染后,可在48h-72h細胞長滿之后,提取細胞蛋白或者RNA,驗證敲減/過表達效率。

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